# E8 Colon RNA：预定义时钟—屏障模块

> **E8 Colon RNA secondary support only; no restoration or mediation inference**

## 设计与统计

- 仅使用 E8 Colon 的 60 个组织样本列（GMF/ZMF × F/M × 5 ZT × 3标本列）；无 animal/cage ID。
- 输入数值来自 raw-count 派生的 `log2(CPM+0.5)`；不读取旧统计结果。
- 每个模块对纳入基因逐基因标准化，再按预设方向求均值。
- 主模型：`score ~ sex + field + sin + cos + field×sin/cos`；HC3；主检验为交互项联合 Wald 2 df；四模块 BH。
- 形状/端点敏感性：分别剔除 ZT0、剔除 ZT24 后重拟合同一 cosinor，并用 categorical-ZT×field 的 HC3 联合 4 df 检验放宽单谐波假设；每个variant在四模块内单独BH。
- marker敏感性在同一模型中加入 epithelial、immune、stromal 三个bulk组成score，只作check-only；为避免机械重叠，从每个marker score中剔除了当前目标模块基因。

## 数值结果

- **Core clock**：纳入 15/16 个预定义基因；field×rhythm χ²=9.459，p=0.00883，q=0.0118，达到预设阈值；drop-ZT0 q=0.116，drop-ZT24 q=0.000126，categorical-ZT×field q=0.000116；加入组成marker后 q=0.364，显著性判定改变。
- **Barrier / mucus**：纳入 24/24 个预定义基因；field×rhythm χ²=37.364，p=7.7e-09，q=3.08e-08，达到预设阈值；drop-ZT0 q=1.29e-10，drop-ZT24 q=0.000126，categorical-ZT×field q=5.72e-09；加入组成marker后 q=0.0163，显著性判定保持。
- **IL22 receptor / STAT3 antimicrobial**：纳入 16/19 个预定义基因；field×rhythm χ²=30.436，p=2.46e-07，q=4.92e-07，达到预设阈值；drop-ZT0 q=1.26e-11，drop-ZT24 q=0.00189，categorical-ZT×field q=7.27e-10；加入组成marker后 q=0.00909，显著性判定保持。
- **NF-kB inflammation**：纳入 18/20 个预定义基因；field×rhythm χ²=6.010，p=0.0495，q=0.0495，达到预设阈值；drop-ZT0 q=0.116，drop-ZT24 q=0.0727，categorical-ZT×field q=0.106；加入组成marker后 q=0.364，显著性判定改变。

## 解释边界

1. 该模块只说明 E8 bulk Colon RNA 中预定义程序的组间波形差异或缺乏差异；不能推断恢复。
2. `IL22 receptor / STAT3 antimicrobial` 指受体/STAT3相关抗菌表达程序；`Il22` 本身未通过Colon表达过滤，结果不证明IL-22配体增加或通路被激活。
3. 组成marker属于暴露后bulk表达读出，既可能反映细胞组成，也可能反映同一生物程序；加入它们可能过度调整。因此主模型保持不调整，marker模型只作敏感性检查，不能替代细胞比例去卷积。
4. RNA与随机粪便样本不配对，不能做菌—代谢物—宿主样本相关或中介分析。
5. 无animal/cage ID；HC3处理异方差，不会消除笼位、装置或批次混杂。
6. 单个基因结果仅供后续实验选择；模块是预定义主分析family。