# 组会结果摘要｜地磁恢复后的肠道时间生态

> 项目：LC-P20260305017  
> 汇报日期：2026-08-15  
> 数据口径：现有宏基因组、非靶向代谢组与 E8 Colon RNA；不新增测序  
> 当前主线：**Earth-field restoration redirects rather than rewinds the gut temporal ecosystem after zero-field exposure**

## 一页执行摘要

### 这周完成了什么

1. 把逐物种、逐功能、逐代谢峰的恢复分析统一为 **E0 校正口径**，不再把 E8 时原始组间差直接当作零磁暴露效应。
2. 用相同统计标准公平比较了四条预定义候选机制轴：SCFA/丁酸、胆汁酸、色氨酸/吲哚、胆碱/TMA。
3. 用 E8 Colon RNA 检验了四个预定义宿主模块：核心时钟、屏障/黏液、IL22 receptor/STAT3-associated 抗菌效应程序、NF-κB 炎症。
4. 所有恢复结论均按**随机粪便、重复横断面群体设计**解释，不再使用同鼠轨迹、配对模型或动物随机效应。

### 当前最稳的结果

- **全局结论保留**：物种、功能和代谢的水平与节律六类几何中，恢复阶段均存在朝暴露前关系回撤的方向分量，bootstrap 95% CI 均大于 0；但恢复点并未沿原暴露轨迹返回。
- **“非原路”证据很清楚**：物种和功能层的路径外偏离从 R+4 到 R+8 反而增加；代谢层虽有所收缩，R+8 仍离原暴露轨迹约一个 E8 偏离长度。
- **E8 宿主锚点较强**：结肠屏障/黏液模块和 IL22 receptor/STAT3-associated 抗菌效应程序的时间波形差异，在 bulk 组成 marker 敏感性模型中仍保持显著。
- **具体代谢机制尚未锁定**：四条候选轴在正式竞争性富集检验中均未达到 BH `q<0.05`，因此目前不能指定“丁酸轴”或其他单一轴为机制主线。
- **`Anaerostipes hadrus`仍可保留为候选物种**：其节律性暴露效应很强，R+4、R+8 均满足方向性节律回归；但丰度水平结果不连续一致，也不能仅凭物种标签推断其产生丁酸。

### 组会建议怎么讲

> **零磁暴露后切回地磁，肠道微生物—代谢时间结构出现方向性回归，但不是沿原路径复原，而是进入一个带有明显路径外重构的新状态；E8 结肠中最稳健的宿主伴随改变落在屏障/黏液与 IL22 receptor/STAT3-associated 抗菌效应程序。现有非靶向数据不足以确定是哪条代谢轴驱动这一过程，下一步应优先用库存样本做靶向定量和结肠验证。**

### 当前决策

- Gate 0（E0 校正统计口径）：**通过**。
- Gate 1（全局方向性、非原路回归）：**支持**，但只能写群体阶段关系，不能写同鼠恢复或严格因果。
- Gate 2（唯一候选代谢轴）：**未通过**；不强讲丁酸机制。
- 下一步重点：库存盘点 → 小型靶向代谢面板 → 菌/功能绝对定量 → 结肠时钟—屏障验证。

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## 1. 设计与正式统计口径

### 1.1 两条来源谱系

- **GMF lineage**：E0 → E2 → E4 → E6 → E8 → R+4 → R+8，全程处于地磁环境；恢复期支路是同期、同年龄、同流程对照。
- **ZMF lineage**：E0 → E2 → E4 → E6 → E8 处于零磁环境；E8 后切回地磁，继续至 R+4、R+8。
- `GMF_R`、`ZMF_R`不是两个全新的独立处理组。R 阶段两支都处于地磁环境，组间差代表来源历史相关的残余差异。

### 1.2 统计单位

- 每个实验格有多只鼠，粪便随机取得；尾号只表示格内标本编号，不是可靠 animal ID。
- 无 cage ID，不能排除笼位、装置或批次混杂。
- 不跨周配对、不画单鼠轨迹、不使用动物随机效应。
- 宏基因组、代谢组和 RNA 未证实标本级配对，因此不能做样本级跨组学相关或中介分析。

### 1.3 节律与预处理

- 低计数 `<4` 置零；保留率至少 20%；正式 CLR 矩阵使用预设方差筛选和零替代。
- 24 h population fixed-effect cosinor；sex 为固定协变量。
- sine/cosine 采用 HC3 robust Wald 2 df 联合检验；正式阈值统一为 BH `q<0.05`。
- 恢复阶段以 E8 为阶段参考，但跨来源谱系方向判定先扣除 E0 基线差。

### 1.4 E0 校正恢复量

设 `B = ZMF_E0 − GMF_E0`：

- `P* = (ZMF_E8 − GMF_E8) − B`：E0 校正的暴露终点偏离；
- `Q*_r = (ZMF_Rr − GMF_Rr) − B`：恢复期残余偏离；
- `S_r = Q*_r − P*`：E8 到恢复期的来源谱系差变化。

方向性水平回归要求 `P* × S < 0` 且 `|Q*| < |P*|`；节律向量使用点积和向量范数做相同判定。GMF 支路自身允许随年龄、时间和流程漂移，不能要求 `GMF_R = GMF_E8`。

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## 2. 正式结果

### 2.1 全局几何：有回撤分量，但不是原路返回

32 个固定 split-half 去噪，1,999 次按 `lineage × stage × sex × ZT` 格内重抽 bootstrap。下表的路径外距离均以 E8 偏离长度 `||D8||` 归一化；0 才表示落在原暴露轨迹上。

| 数据层 | 分量 | R+4 路径外距离 | R+8 路径外距离 | 初始反向 cosine（95% CI） | R+4→R+8 朝 E0 cosine（95% CI） |
|---|---|---:|---:|---:|---:|
| Species | level | 1.000 | 1.289 | 0.489（0.485–0.493） | 0.542（0.530–0.553） |
| Species | rhythm | 0.554 | 0.726 | 0.600（0.593–0.606） | 0.270（0.247–0.290） |
| Function | level | 1.012 | 2.257 | 0.725（0.643–0.832） | 0.825（0.745–0.907） |
| Function | rhythm | 0.371 | 0.710 | 0.676（0.661–0.690） | 0.040（0.014–0.065） |
| Metabolite | level | 1.210 | 1.004 | 0.156（0.044–0.254） | 0.684（0.627–0.740） |
| Metabolite | rhythm | 1.103 | 0.949 | 0.511（0.422–0.590） | 0.566（0.498–0.633） |

**解释**：六类中两种方向 cosine 的 95% CI 均大于 0，说明都有与回撤相容的方向分量；但路径外距离普遍不接近 0。物种与功能在 R+8 的路径外分量进一步增大，代谢虽然收缩，仍约为 `1 × ||D8||`。因此主表述应是“partial, non-retracing return”，不是“恢复正常”。

### 2.2 E0 校正后逐特征方向性调用

下表为同时满足 E0 校正暴露、恢复变化、IUT、方向与效应要求的正式调用数。

| 数据层 | R+4 水平 | R+8 水平 | R+4 节律 | R+8 节律 |
|---|---:|---:|---:|---:|
| Species（6,673） | 259 | 322 | 2,838 | 1,892 |
| Function（2,838） | 30 | 32 | 1,068 | 802 |
| Metabolite（1,171） | 45 | 31 | 41 | 31 |

**解释**：方向性变化主要集中在微生物分类与功能的节律向量，而不是少数平均丰度。代谢层的正式候选数在 E0 校正后明显收紧，提示旧的 raw-E8 锚点会放大部分候选。

### 2.3 E8 Colon RNA：屏障/黏液与 IL22 receptor/STAT3-associated 抗菌效应程序最稳健

模型为 `module score ~ sex + field + sin + cos + field×sin/cos`；主检验是 `field×rhythm` 的 HC3 2 df 联合 Wald，四模块 BH。

| 预定义模块 | 主模型 q | 加 bulk 组成 marker 后 q | 当前判定 |
|---|---:|---:|---|
| Core clock | 0.0118 | 0.364 | 对组成假设敏感 |
| Barrier / mucus | 3.08×10⁻⁸ | 0.0163 | **稳健保留** |
| IL22 receptor/STAT3-associated antimicrobial | 4.92×10⁻⁷ | 0.00909 | **稳健保留** |
| NF-κB inflammation | 0.0495 | 0.364 | 对组成假设敏感 |

**解释**：E8 bulk Colon RNA 支持零磁条件下结肠屏障/黏液和 IL22 receptor/STAT3-associated 抗菌效应程序的时间波形不同。`Il22` 本身未进入过滤后的表达矩阵，因此不能写成“IL22 被激活”。核心时钟与 NF-κB 的主模型信号在组成敏感性中消失，因此不作为最硬结论。该结果只覆盖 E8，不能用于恢复或中介推断。

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## 3. 候选结果：可以保留，但不能写成机制结论

### 3.1 四条机制轴没有唯一胜者

四轴均用透明词典、相同正式调用标准和同层背景做单侧 Fisher 竞争检验，并在四轴内 BH：

- SCFA/丁酸：10 个功能条目；非靶向代谢仅严格命中 valerate/isovalerate，没有乙酸、丙酸或丁酸候选峰；
- 胆汁酸：47 个候选代谢峰，功能矩阵中无预定义命中；
- 色氨酸/吲哚：6 个功能条目、24 个候选代谢峰；
- 胆碱/TMA：7 个功能条目、5 个候选代谢峰。

**正式结果**：没有任何轴在正式端点上达到竞争性富集 `q<0.05`，Gate 2 未通过。

唯一敏感性信号来自“单候选且 ConfidenceScore≥3.7”的 214 峰严格背景：色氨酸/吲哚代谢峰子集的 E8 节律为 8/16，而全背景为 39/214，OR=5.39，四轴 BH `q=0.0104`。这是候选结构的敏感性结果，必须经标准品确认，不能替代主结果。

### 3.2 `Anaerostipes hadrus` 是假说锚点

- E0 校正 E8 节律效应：`q=1.28×10⁻³³`；
- 方向性节律回归：R+4 `q=1.24×10⁻¹⁰`，R+8 `q=0.00124`；
- 水平效应：R+4不满足正式回归，R+8满足；跨阶段不连续一致。

所以可写：**“`A. hadrus`是后续绝对定量的优先候选物种。”** 不能写：**“`A. hadrus`通过丁酸介导结肠恢复。”**

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## 4. 目前不可下的结论

1. 不能说“恢复地磁使菌群恢复正常”；当前证据是方向性、部分、非原路回归。
2. 不能说 GMF_R 应与 E8 GMF 完全相同；GMF 支路本身存在年龄/流程漂移。
3. 不能说同一只鼠逐步恢复；粪便为随机取得的重复横断面标本。
4. 不能把 PCoA 二维距离当作是否恢复的检验；正式判断来自全特征几何与 bootstrap CI。
5. 不能指定丁酸、胆汁酸、吲哚或胆碱轴为已证实机制；四轴主竞争检验均未胜出。
6. 不能把非靶向峰的候选名称当作结构确认；需要 authentic standard。
7. 不能从群体功能矩阵证明某物种产生某代谢物，也不能做菌—代谢物—宿主中介。
8. 不能从 E8 Colon RNA 推断恢复阶段宿主变化；Recover RNA 需要先确认样本和 ZT 映射。
9. 不能宣称切回地磁的严格因果效应；E8 后没有继续维持 ZMF 的反事实支路。
10. 不能用“差异不显著”证明两支相同；如要讲恢复至对照范围，需要预设等效界值并做 TOST/CI。

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## 5. 下一步非测序实验优先级

### A0｜先盘点库存，决定项目能走多远

- 冻存粪便是否覆盖 E0、E8、R+4、R+8、5 ZT、两性；
- 剩余质量、冻融次数、保存条件、原始管号及与现有矩阵的对应关系；
- 是否有可按 stage、ZT、sex 映射的结肠鲜冻组织、RNA、蛋白或 FFPE；
- 是否有血清/血浆、盲肠内容物；
- 是否保留非靶向代谢原始文件、QC、MS/MS 和标准品条件。

### A1｜四轴小型靶向代谢面板

不要直接只测丁酸。首轮建议：

- SCFA：乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、琥珀酸，可加异丁酸、异戊酸；
- 色氨酸/吲哚：tryptophan、indole、IAA、IPA；
- 胆汁酸：CA、DCA、LCA、βMCA/TβMCA 等小鼠代表物；
- 胆碱轴：choline、betaine、TMA、TMAO。

要求绝对定量、内标、QC、跨组随机进样；正式分析仍使用 E0 校正、同期 GMF 对照和 5 ZT cosinor。

### A2｜菌和功能基因绝对定量

qPCR/ddPCR 小面板：总 16S、`A. hadrus`特异标记、butyryl-CoA:acetate CoA-transferase、`buk`、`tnaA`、`baiCD`、`cutC`。只有候选菌/功能绝对量和对应靶向代谢轴同时支持，才升级具体机制。

### A3｜结肠时钟—屏障验证

- RT-qPCR：`Arntl/Per2/Cry2/Nr1d1/Dbp`；`Muc2/Tjp1/Ocln/Cldn1`；`Reg3g/Socs3`；炎症只作次级。
- 至少增加一个正交层：ZO-1/OCLN/MUC2 的 Western 或 IF/IHC，p-STAT3/STAT3，或 H&E＋AB-PAS 盲法评分。
- whole-colon 结果只能写组织伴随改变，不能写上皮细胞特异机制。

### B｜只有 A 级胜出后再做轻量机制

- 用胜出的真实代谢物做结肠类器官或同步化 Caco-2/HT-29：时钟时间序列＋TEER/FITC-dextran/ZO-1/MUC2；
- 加入生理浓度、毒性、pH/渗透压控制，以及一个阻断或回补；
- 归档粪水—上皮实验可作为低成本增强，但要有至少 3 个不重叠样本池。

FMT、定义菌群和体内补救只作远期保留，不作为本轮论文启动条件。

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## 6. 组会上需要问师姐的问题

### 样本与实验设计

1. 每个 `lineage × stage × ZT × sex` 格原来有多少只鼠、多少笼？粪便是如何从鼠和笼中随机取得的？
2. 是否还保留动物号、笼号、房间/装置位置、采样日期、提取批次、测序批次或质谱批次记录？
3. R+4 的 `ZMF × ZT24 × M` 四份宏基因组缺失标本，实体粪便是否仍在？缺失发生在采样、提取、建库还是数据交付？
4. 体重或其他表型是否覆盖各阶段、ZT、性别？能否恢复原始记录及单位？

### 库存材料

5. E0、E8、R+4、R+8 的冻存粪便还剩多少？是否能可靠对应 stage、ZT、sex 和现有 sample ID？
6. 是否有结肠鲜冻组织、剩余 RNA/蛋白或 FFPE，尤其是 R+4、R+8；是否有明确 ZT 映射？
7. 是否保留血清/血浆、盲肠内容物，或同一原始粪便的相邻分装？
8. 非靶向代谢是否保留 raw 文件、MS/MS、混合 QC、内标信息和原始上机顺序？候选峰能否补标准品确认？

### 可实施平台与经费

9. 现有平台或合作单位能否做带稳定同位素内标的靶向 SCFA、胆汁酸、吲哚和胆碱轴面板？
10. 能否做物种/功能基因 qPCR 或 ddPCR、结肠 RT-qPCR、Western、IF/IHC、H&E 和 AB-PAS？
11. 能否做小规模结肠类器官或 Caco-2/HT-29 的 TEER/FITC-dextran；如果只能选一个，优先哪个平台？
12. 本轮可接受的样本消耗、预算和完成周期是多少？是否能先用 5%–10% 平衡样本做方法学预实验？

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## 7. 建议组会后立即锁定的事项

1. 一周内完成库存表，标出可用于 E0/E8/R+4/R+8、5 ZT 验证的真实样本数。
2. 在知道库存和平台后，只立一个最小靶向面板，不先押注丁酸。
3. 若恢复期结肠组织无法映射 ZT，宿主结论暂时停在 E8，不强接恢复故事。
4. 若 A2/A3 获得跨层一致结果，再决定是否启动类器官/上皮阻断或回补。
5. 论文当前标题和图版以“方向性、非原路回归＋E8 屏障/IL22 宿主锚点”为主；具体代谢物留待 Gate 3。

## 8. 本次结果来源

- `analysis/18_full_reanalysis/integration/RESULTS_SUMMARY.md`
- `analysis/18_full_reanalysis/integration/outputs/recovery_geometry_ci.csv`
- `analysis/18_full_reanalysis/recovery_e0_adjusted/RESULTS_SUMMARY.md`
- `analysis/19_mechanism_axis_prioritization/RESULTS_SUMMARY.md`
- `analysis/19_mechanism_axis_prioritization/outputs/species_hypothesis_anchor.csv`
- `analysis/19_colon_clock_barrier/RESULTS_SUMMARY.md`
- `docs/research/final_research_blueprint_20260813.md`
- `docs/research/nonsequencing_wetlab_checklist_20260813.md`