# 组会汇报稿

版本：2026-08-15。以下顺序与网页当前主图一致。原来的图 3、图 4、图 5 已合并为现在的图 3，实验设计保留在图 1，后续图号顺延。

## 图号速查

图 1 讲实验分组和复磁时间点；图 2 讲群落组成与 Shannon 多样性；图 3 统一清点节律数量、E8 组间波形差异、七阶段交集和 UpSet 组合；图 4 讲逐特征的复磁回撤；图 5 讲整体轨迹是否沿原路返回；图 6 讲候选机制轴，并说明 A. hadrus 的物种筛选来路；图 7 和图 8 讲组织 RNA 与 SCN；图 9 聚焦结肠屏障、黏液和 IL22R/STAT3 相关抗菌程序。节律稳健性检查属于统计方法审计，放在补充图 S5。

项目：LC-P20260305017  
建议时长：主图完整讲 15 至 18 分钟；补充图只在被问到时打开  
配合页面：`figure-layout-report.html`

建议从网页顶部开始，只向下滚动，按图 1 到图 9 的顺序讲；图 S5 只在被问到统计稳健性时打开，不再来回跳图。

## 汇报前先记住几个词

这几项不必单独念，可以在第一次出现时顺手解释。

- **GMF**：正常地球磁场，是对照环境。
- **ZMF**：接近零磁场，是实验环境。
- **E0 到 E8**：零磁或地磁暴露阶段。E0 是起点，E8 是暴露 8 周。
- **R+4 和 R+8**：暴露 8 周以后，两条来源谱系都回到正常地磁场，再观察 4 周或 8 周。R 指 recover。
- **ZT**：一天中的采样时刻。ZT0、ZT6、ZT12、ZT18、ZT24 相当于用 5 个时点覆盖一个昼夜。
- **水平变化**：这个特征一天的平均量变了多少。
- **节律变化**：这个特征一天中何时升高、何时降低，以及起伏有多大。平均量相同，也可能有完全不同的节律。

## 开场，约 40 秒

大家好，今天我想回答一个具体问题：小鼠经历 8 周零磁以后，再回到正常地磁场，肠道菌群和代谢物原来的昼夜变化会不会回来。

这批数据包括 836 份粪便宏基因组、840 份粪便非靶向代谢组，以及两批组织 RNA。

第一批是 E8 RNA，共 744 个组织样本列。其中 684 列来自 17 种普通组织，另外 60 列来自视交叉上核，也就是 SCN。17 种普通组织中，有 10 种组织带完整的 5 个昼夜采样时刻，另外 7 种组织没有 ZT，只能比较平均表达水平。SCN 也有完整的 5 个 ZT。第二批是 252 列 Recover RNA，但目前缺少恢复周和 ZT 映射，暂时不能做恢复期节律分析。

这里的 744 和 252 都是表达矩阵中的样本列数，不是独立动物数。不同组织是否来自同一只鼠也没有可靠映射，因此不能把跨组织结果连成同一只鼠的器官变化轨迹。

粪便数据覆盖 E0、E2、E4、E6、E8、R+4、R+8。每个阶段都有 5 个昼夜采样时刻，也包含雌雄两种性别。

但是粪便是随机取得的，没有可靠的 animal ID 和 cage ID。所以这不是同一只鼠从零磁到复磁的纵向轨迹。我们能讲的是各阶段群体的变化，不能讲某一只鼠恢复了。

先把结果说在前面。

第一，零磁暴露确实伴随菌群和代谢节律改变，但变化不是暴露越久越大，而是在不同阶段重新组合。

第二，回到地磁场以后，部分物种、功能和代谢物朝暴露前方向回撤；从整体轨迹看，系统没有沿原来的暴露路线返回，也没有完全回到起点。

第三，四条预设代谢机制轴都没有通过正式竞争检验，目前不能指定丁酸、胆汁酸或其他单一机制。E8 组织 RNA 显示的是组织特异性变化，其中结肠屏障、黏液和 IL22R/STAT3 相关抗菌程序最稳定。

所以目前最稳妥的主线是：复磁带来部分方向性回归，但肠道时间生态没有按原路径复原。具体由什么代谢物和宿主通路介导，还需要库存样本实验来验证。

## 1. 实验设计和分析口径，约 1 分钟

[打开图 1]

### 图 1：实验怎样分组，复磁从什么时候开始

图 1 不是结果图，它先说明样本是怎么来的。左上是一直处于地磁场的 GMF 来源谱系，左下是 E0 到 E8 处于零磁场的 ZMF 来源谱系。两条横线上的圆点是 E0、E2、E4、E6 和 E8 的采样阶段。

图中虚线右侧是复磁期。两条来源谱系在 E8 以后都进入正常地磁场，继续观察 4 周和 8 周，也就是 R+4 和 R+8。上面一条成为 GMF_R，是持续地磁的时间和流程对照；下面一条成为 ZMF_R，代表零磁暴露后的复磁支线。

左侧时间轴说明：复磁只从 E8 以后开始，而且 R+4 和 R+8 都是在 GMF 条件下观察到的来源谱系差异。

右侧昼夜轴说明每个完整实验格怎样构成：5 个 ZT、2 种性别、每个性别 6 个格内编号，通常合计 60 份粪便样本。这里的圆点是采样时刻，不是一只鼠连续走过的轨迹。

所以 R+4 和 R+8 时，两组其实都在地磁环境里。此时看到的差异，不是当前有没有磁场的差异，而是两组此前经历不同留下的残余差异。GMF_R 是同期、同年龄、同流程的对照，不能用 E8 的 GMF 直接代替它。

右侧采样结构说明：每个完整阶段通常有 60 份随机粪便标本，但这些标本不能拼成同一只鼠的纵向轨迹。

统计上，我们先在每个阶段、每条来源谱系内问一个基础问题：某个物种、功能或代谢物，在一天中有没有相对规律的升降。

这里用 24 小时 cosinor。它可以理解为，用一条周期固定为 24 小时的波形去拟合 5 个采样时刻，再检验这条波形是不是真的有起伏。模型同时纳入性别，避免把雌雄差异误认为昼夜节律。

因为一次会检验几千个特征，不能只看普通 P 值。我们统一使用 BH q<0.05。这里的 q 值是多重检验校正后的显著性指标，用来控制在大量筛选中出现的假阳性。q<0.05 表示这个特征通过了预设筛选线，不表示它的变化一定很大。

比较零磁效应和复磁效应时，还必须做起点校正。原因是 GMF 和 ZMF 在 E0 已经存在来源差异。如果直接比较后面的两组，起点差也会被算进零磁效应。

我们的做法是先扣掉 E0 已有的组间差，再看 E8 新增了多少差异，以及复磁后还剩多少差异。网页公式中的 P* 和 Q* 只是计算符号。汇报时不必念符号，直接说"扣除起点差后的暴露偏离"和"复磁后仍然存在的偏离"即可。

图 1 要讲清楚的只有两点：复磁从暴露 8 周以后开始；后面的所有组间比较都要扣除 E0 起点差，恢复期还要使用同期 GMF_R 对照。否则会把来源差、年龄和流程变化误写成磁场效应。

分组和统计口径先固定下来，下一步先看一个最基本的问题：这些阶段的菌群整体组成有没有真的发生变化。

## 2. 群落整体有没有变化，约 50 秒

[继续向下打开图 2]

### 图 2：菌群整体组成和多样性有没有变化

图 2 先看最常规的菌群整体结果。A 面板是 Bray-Curtis PCoA，每个点是一份粪便样本。点越近，物种组成越相似；点越远，组成差异越大。大点和区间表示同一阶段的群体中心及其不确定性。图里不连接阶段，因为这些不是同一只鼠的连续样本。

A 说明：群落不是一个静止不动的整体，而是会随来源和阶段重新排布；这张图只能说明整体组成变了，不能说明昼夜节律或恢复机制。

B 面板是原始 Shannon 分布。它把一份样本里物种的丰富度和均匀度压成一个数。这里每个小点就是一份粪便样本，空心大点和区间是该组均值及其不确定性。B 只让我们看原始数据长什么样，不负责判断组间效应。

B 说明：每份粪便里的物种丰富度和均匀度会随阶段波动，但这个总指标不会告诉我们究竟是哪些菌在变化。

C 面板才是正式的七阶段比较。灰色方块是 E0 时两条来源支线原本相差多少；红色圆点是 E2 到 E8 在扣掉这一起点差之后，零磁支线相对 GMF 新增了多少差异；紫色菱形是 R+4 和 R+8 回到 GMF 后仍剩多少差异。点在零左边表示 ZMF 来源支线的 Shannon 更低，区间跨零表示方向还不能确定。结果最清楚的是 E4 和 R+4 明显降低，E8 和 R+8 则接近零。

C 说明：多样性变化更像阶段性波动，而不是随着零磁时间持续累积的损耗；到 E8 和 R+8，整体丰富度差异已经不再明显。

PCoA 适合做整体概览，但二维图会丢失很多信息。图上两团点靠近，不能证明零磁完全没有作用；相距较远，也不能直接解释成同一只鼠没有恢复。这里先确认群落整体会变，后面再进入本项目真正关心的昼夜节律。

图 2 的结论是：群落组成会随来源和阶段变化；Shannon 的组间差异也不是单调累积，而是在 E4 和 R+4 最明显，到 E8 和 R+8 又接近零。PCoA 只能说明整体结构不同，不能单独回答零磁是否改变节律，也不能证明复磁是否恢复。

这一步只告诉我们“群落整体变没变”，还没有回答“哪些成员在一天中的变化变了”。因此，下面把视角从整体距离转到每个物种、功能和代谢物的 24 小时节律。

## 3. 建立节律图谱，约 2 分钟

[继续向下打开图 3]

### 图 3：一张图看完节律数量、共有成员和阶段稳定性

A 面板是第一轮节律清点。每一格对应一个来源、一个阶段和一个数据层。格内同时给出通过 BH q<0.05 的实际数量和比例。数量告诉我们筛出了多少条目，比例告诉我们它占该层全部可分析特征的多少。物种、功能和代谢的总特征数不同，所以只看百分比或只看数量都会误导。

A 说明：物种、功能和代谢物都存在昼夜变化，但节律成员会随着阶段重新洗牌，不能把它理解成暴露时间越长，节律就越多。

B 面板问的是另一个问题：到 E8 时，ZMF 和 GMF 的波形到底有没有差异。这里先扣除 E0 已有的来源差，再检验组别和节律波形的交互。物种、功能和代谢中分别有 75.9%、78.9% 和 22.0% 的可分析特征通过这一检验。这不代表所有变化都很大，只表示波形差异的统计证据超过了预设筛选线。

B 说明：到 E8，零磁改变的不只是菌群有多少，还改变了许多物种和微生物功能在一天中的变化时间；代谢物层的同步变化相对少一些。

C 面板有三行，依次是物种、功能和代谢；七列依次是 E0、E2、E4、E6、E8、R+4 和 R+8。每个小图中，左圈是 GMF 来源谱系检出的节律成员，右圈是 ZMF 来源谱系检出的成员，中间交叠部分是两组共有。圆面积和交叠面积按数量缩放，数字是实际条目数。

C 说明：两条来源谱系始终保留一部分共同节律，但各自也会出现特异成员，说明零磁影响更像改变了节律群落的组成，而不是让所有节律一起消失。

这张图回答的是成员更替，不是正式组间差异。某个条目只出现在一个圆里，可能来自真实改变，也可能来自检测能力和阈值附近波动。不能因为一组显著、另一组不显著，就说两组显著不同。

D 面板是 UpSet 图，可以理解为多阶段版的韦恩图。三个小图分别对应物种、功能和代谢。下方每一列黑点表示一个精确的阶段组合，连线把属于同一组合的阶段接起来；上方成对柱表示 GMF 和 ZMF 中符合这个组合的条目数。网页只画数量最多的 10 种组合，完整排列组合保存在下载表里。

D 说明：有些节律只在某个阶段短暂出现，有些能跨多个阶段保留，说明系统同时包含阶段特异变化和相对持久的节律成员，没有一套模式贯穿整个实验。

例如，一列只在 E8 有黑点，表示这些特征只在 E8 被检出有节律；一列从 E0 连到 R+8，表示它在多个指定阶段反复通过节律判定。这里看的是重复出现模式，不是同一只鼠的纵向变化。

这里的"功能"不是宿主基因表达，也不是 KEGG 富集。宏基因组矩阵已经把微生物序列汇总成 2,838 个功能注释条目。每个功能条目像物种一样接受 24 小时节律检验。因此，它表示菌群携带的功能潜力怎样变化，不等于相应代谢反应已经在体内发生。

图 3 的结论是：三个数据层都存在广泛的 24 小时节律；节律成员会随阶段重新组合，一部分成员能跨多个阶段反复出现；到 E8 时，零磁相关的波形差异覆盖大量物种和微生物功能，代谢物层面的比例相对较低。A、C、D 负责清点成员，只有 B 是正式的组间波形检验。

图 3 先回答了“节律有多少、哪些阶段共有、E8 两组波形是否不同”。接下来要把同一套口径沿着 E0 到 R+8 展开，看看暴露效应怎样出现，又有多少特征在复磁后朝原方向回撤。

## 4. 暴露效应和逐特征复磁响应，约 1 分 30 秒

[继续向下经过暴露阶段表，再打开图 4]

### 图 4：复磁后有多少特征朝暴露前方向回撤

先看暴露阶段。扣除 E0 起点差后，E2、E4、E6、E8 的物种、功能和代谢物调用数并没有随暴露时间一路增加。不同阶段的变化规模会扩大，也会缩小，说明零磁作用更像阶段性重排，而不是简单的时间累积。

图 4 接着问复磁以后，每个特征有没有朝暴露前方向回撤。六行依次是物种、功能和代谢的平均水平与节律波形。左半边先显示持续 GMF 支线从 E8 到 R+4、R+8 自己漂移了多少，提醒我们同期对照并不是静止的；右半边显示 ZMF 来源谱系中，有多少 E8 净偏离在复磁后方向相反且幅度缩小。R+4 和 R+8 用不同点形区分，数字同时给出调用数和分母。

A 说明：即使一直处于地磁场，群体状态也会随时间和流程继续变化，所以恢复不能拿 E8 的 GMF 当成一条冻结不动的基线。

B 说明：回到地磁场后，零磁来源支线出现了朝暴露前方向的回撤，但它是部分回撤，不是整个系统同步恢复。

物种层共有 6,673 个可分析特征。R+4 和 R+8 的水平回撤分别为 259 和 322 个，节律回撤分别为 2,838 和 1,892 个。功能层共有 2,838 个特征，对应数量是水平 30 和 32 个，节律 1,068 和 802 个。代谢层共有 1,171 个特征，对应数量是水平 45 和 31 个，节律 41 和 31 个。

这些分层结果说明：复磁对一天中变化节奏的影响比对全天平均量更广，但恢复时间拉长并不保证所有层面都继续向原状态靠近。

这些数字说明复磁响应确实存在，但调用数量不能直接当成效应强弱。不同数据层的特征总数和检测能力并不相同。

图 4 的结论是：复磁后确实有一批特征朝暴露前方向回撤，而且物种和功能的节律回撤比平均水平回撤更普遍。不过，R+8 的回撤数量并没有在所有数据层都高于 R+4，因此不能把复磁解释成随时间稳定增强的恢复过程。

这里看到的是逐个特征的回撤。可是，很多特征各自往回走，并不等于整个群体状态沿原来的路线返回。下一个问题要把这些特征合在一起，从整体几何上检查这件事。

## 5. 整体是否沿原路恢复，约 1 分 30 秒

[继续向下打开图 5]

### 图 5：系统有没有沿着原来的暴露路线返回

逐个特征有回撤，不等于整个系统回到了原来的状态。图 5 把所有特征合在一起，看群体状态在高维空间里怎样移动。

A 面板是示意图，定义两个量。方向余弦为正，表示恢复移动中有朝 E0 的分量；路径外距离为零，才表示恢复点落在原来的暴露路线上。

A 说明：系统可以一边朝暴露前方向移动，一边偏离原来的路线；“往回走”与“原路返回”不是同一件事。

B 面板比较 R+4 和 R+8 的路径外距离。点越靠近零，越接近原暴露路线；数值增大，表示恢复状态在另一条方向上继续重构。

B 说明：恢复点仍然落在暴露路线之外，说明复磁后出现的是新的群体状态重构，而不是把零磁过程倒放一遍。

C 面板比较初始回撤和 R+4 到 R+8 的晚期移动方向。点和区间位于零的右侧，表示该阶段移动中含有朝 E0 的方向分量。这里的区间来自在相同实验设计格内反复重抽样。

C 说明：恢复后期确实还在向暴露前方向移动，但同时也在继续形成新的变化方向，这正是“部分回归而非原路复原”的图形证据。

可以把它想成一张路线图。E0 是出发点，E2 到 E8 连成零磁暴露路线，R+4 和 R+8 是回到地磁场后的两个位置。恢复点靠近 E0，表示有往回走的成分；恢复点离原暴露路线很远，表示它走了另一条路，而不是把暴露过程倒放一遍。

物种、功能和代谢物的水平与节律，共六类结果，都有朝 E0 靠近的分量。我们在相同实验设计格内反复重抽样，检查这一方向会不会被少数样本带动。图中的 bootstrap 就是这项检查，重抽样后方向没有改变。

但是，恢复点没有贴着原暴露路线返回。物种和功能在 R+8 离原路线甚至比 R+4 更远。代谢层离原路线的距离有所缩小，但到 R+8 仍然大约相当于 E8 时离起点的距离。

因此可以说"复磁后有部分方向性回归，同时形成新的时间生态状态"，不能说已经恢复正常。GMF_R 和 GMF 在 PCoA 上相距较远也不自动表示数据有问题，因为同期 GMF 支线本身会随时间和流程变化，粪便又不是同鼠追踪。

图 5 是整篇分析最重要的结论：复磁产生了朝暴露前状态移动的方向分量，但系统没有沿原路返回。这里观察到的是群体阶段的部分回归和持续重构，不是同一只鼠恢复正常。

不过，整体几何结论建立在前面节律调用的基础上。节律稳健性检查属于统计方法审计，不占用正文主线。图 3 的主 cosinor 结果先用于回答“有哪些节律、哪些组间波形不同”；端点删除、波形偏离和 ZT 置换校准统一放到补充图 S5，被问到时再说明主结果是否依赖某一个采样时点或标准正弦假设。

稳健性检查之外，下一步把候选机制预先分成四条轴，看看现有数据能不能先排出实验优先级。

## 6. 机制候选现在走到哪一步，约 1 分钟

[继续向下打开图 6 和 A. hadrus 文字区]

### 图 6：现有数据最支持哪条候选机制轴

图 6 比较四条预先选定的候选路径：SCFA/丁酸、胆汁酸、色氨酸/吲哚和胆碱/TMA。A 面板是主分析，功能层和代谢层分别与各自完整背景比较。每个格子的颜色表示候选轴相对背景是否更集中出现，格内数字是命中数除以该轴的可分析条目数。

A 说明：现有组学结果没有把变化集中指向某一条预设代谢轴，当前还不能把丁酸、胆汁酸或其他单一介质写成主机制。

B 面板是更严格的代谢物注释敏感性分析，只保留单一候选且置信度较高的峰。这里色氨酸/吲哚轴出现信号，但它不属于正式主结果。

B 说明：色氨酸/吲哚可以作为下一步实验的线索，但还只是候选结构，不能把这条线索当成已经确认的代谢机制。

现阶段不能指定某一条机制。非靶向代谢组先检测峰，再根据谱图给出候选名称；候选名称不等于化学结构已经确认。因此，目前的数据不能直接证明"就是丁酸"或者"就是胆汁酸"。

色氨酸/吲哚在一个严格敏感性分析中有信号，但这些峰仍然只是候选结构，需要用标准品核对保留时间和碎片谱。

### 候选物种筛选图：A. hadrus 不是唯一通过者

这一步没有另起一套筛选标准。我们把种水平的 6,673 个物种都放进同一个节律回归筛选：R+4 和 R+8 的节律联合 q 值都小于 0.05，而且两个阶段的方向都朝暴露前方向。共有 1,408 个物种通过。

`Anaerostipes hadrus` 是预先指定的 SCFA/丁酸假说锚点。它在两个恢复阶段都通过同一规则，所以单独标出来，但它不是四条候选机制轴竞争中的赢家，也不是 1,408 个通过者里唯一最强的物种。图 C 又放了 6 个最弱阶段 q 值略高于它的同规则通过者，告诉大家这个结果不是“全量筛一遍只剩 A. hadrus”。

因此，A. hadrus 现在的正确用法是：它是一个有两阶段节律回撤证据、适合优先做物种特异定量的假说锚点。它不能单凭物种名字证明丁酸生成，更不能证明丁酸已经介导宿主效应。

图 6 的结论是：现有数据可以排出实验优先级，还不能确定唯一机制。色氨酸/吲哚和 `A. hadrus` 值得优先验证，但都不能直接写成已经成立的因果链。

既然微生物和代谢层还没有锁定唯一介质，下一步就看宿主端有没有一个稳定、可验证的落点。先看不同组织是否都朝同一个方向变化，再单独看 SCN 和结肠。

## 7. 宿主端有没有对应信号，约 1 分 30 秒

[继续向下依次打开图 7、图 8 和图 9]

先说明边界：正式可分析的 RNA 只有 E8 普通组织和 E8 SCN。Recover RNA 缺少可靠的 R+4/R+8 和 ZT 映射，所以这三张图回答的是“暴露 8 周时宿主哪里发生了变化”，不能回答复磁后是否恢复。

### 图 7：E8 宿主 RNA 的组织差异

图 7 比较 GMF 和 ZMF 在不同组织的表达和昼夜变化。气泡越大，表示通过统计检验的基因比例越高；没有 ZT 的组织只能看平均水平。皮下脂肪的保守节律比例增加约 28.5 个百分点，而肝、肺、肾、结肠分别下降约 12.5、9.2、7.7、6.9 个百分点。

结论：变化有组织差异，不是全身时钟统一变弱。图 7 只有 E8，不能说明复磁恢复，也不能证明菌群导致宿主变化。

### 图 8：SCN 和核心时钟基因是否整体失稳

图 8 检查 16 个预先指定的核心时钟基因。A 看各组织还剩多少稳定节律，B 看 GMF 和 ZMF 的昼夜波形是否不同。`Arntl` 是 BMAL1，`Rorc` 参与时钟调控和免疫调节；两者 waveform q 约为 0.0465 和 0.0474。

结论：SCN 整体没有可靠失稳，只看到少数接近阈值的波形调整。不能说中央时钟崩溃，也不能据此建立脑肠轴传递链或判断复磁恢复。

SCN 没有出现整体崩溃，下一步就把问题收窄到与肠道菌群距离最近的结肠，检查哪些宿主程序最稳定。

### 图 9：结肠中哪些宿主程序最稳定

图 9 把重点收窄到结肠。A 看两组模块在 5 个 ZT 的波形，B 把平均水平和昼夜波形分开，C 检查删去端点、改用离散时间模型和加入 bulk 组成 marker 后是否仍成立。

屏障/黏液模块的波形 q 约为 3.08×10⁻⁸，IL22 receptor/STAT3 相关抗菌模块约为 4.92×10⁻⁷；加入 marker 后 q 仍为 0.0163 和 0.00909。结论：这两组是目前最值得做湿实验的宿主候选。

但 `Il22` 本身没有通过过滤，所以不能说 IL-22 已被激活；bulk 结肠 RNA 也不能证明上皮细胞机制，更不能从 E8 推断复磁恢复或菌群介导。

图 7 到图 9 合起来说明：宿主变化是组织特异的，SCN 没有整体崩溃，结肠屏障、黏液和 IL22R/STAT3 相关抗菌程序是当前最稳定的候选锚点，但还只是 E8 的关联证据。

到这里，主线就接上了：群落整体发生阶段性变化，节律成员和波形也发生重排，复磁后出现部分回撤，但整体没有沿原路线返回；宿主端目前只有 E8 结肠的屏障、黏液和 IL22R/STAT3 相关抗菌程序可以作为后续验证的候选锚点。下面用四句话收束结果，再说明下一步实验怎样接上这条线。

## 8. 最后总结，约 1 分钟

最后只保留四个结论。

一，零磁暴露伴随菌群和代谢时间结构的阶段性重排，变化并不随暴露时间单调增加。

二，复磁后出现了可重复的方向性回撤，但系统没有沿暴露路线复原。我们观察到的是部分回归和持续重构，不是完全恢复。

三，E8 宿主 RNA 支持组织特异性重排。结肠屏障、黏液和 IL22R/STAT3 相关抗菌程序是目前最稳定的宿主端结果。

四，现有数据还没有锁定具体代谢介质，也没有完成菌群到宿主的因果链。四条候选机制轴的正式竞争检验都没有赢家。

长期零磁动物实验成本过高，下一步先利用现有库存。首先核对 E0、E8、R+4、R+8 的粪便和结肠材料能否对应 ZT、性别和原始编号。随后用带标准品的靶向方法测 SCFA、胆汁酸、色氨酸/吲哚和胆碱相关代谢物，同时对候选菌和功能基因做绝对定量。若有保存合格的结肠材料，再验证时钟、屏障和炎症相关指标。

如果靶向代谢、绝对定量和结肠结果能指向同一条轴，再考虑类器官或上皮细胞的阻断和回补实验。

也就是说，现有数据先负责把变化位置和候选方向找出来，库存样本实验再负责确认化学实体和结肠功能。这样下一步实验是接着数据往下验证，而不是另起一条故事线。

## 9. 组会上请师姐帮助确认的事，约 40 秒

最后我想请大家帮忙核对四类信息。

第一，原实验有多少笼、多少独立装置，粪便当时是怎么随机取得的。

第二，是否还有 E0、E8、R+4、R+8 的冻存粪便和结肠材料，能否对应阶段、ZT 和性别。

第三，是否保留体重、采样日期、提取批次、质谱原始文件、MS/MS 和内标信息。

第四，现有平台能否支持靶向 SCFA、胆汁酸、吲哚和胆碱轴，qPCR/ddPCR，以及结肠的 qPCR、Western、IF 或组织学。

这些信息决定我们下一步能把故事推进到哪一步。

## 补充图被问到时怎么讲

### 图 S1：代谢组数据是否稳定

A 面板是全部生物样本和 pooled QC 的 PCA。QC 点聚得越紧，说明仪器重复性越稳定；它不用于解释生物分组。B 面板是各代谢峰在 QC 中变异系数的累计分布，30% 阈值得到 1,171 个主分析峰，20% 阈值得到 814 个更严格的敏感性峰。C 面板展示每个样本总信号强度，用来检查极端样本和批次漂移。

A 说明：QC 样本聚集，说明技术重复性达到进入主分析的要求；PCA 在这里是质量控制，不是用来证明生物分组。

B 说明：大多数进入主分析的峰在 QC 中相对稳定，收紧阈值只是为了做更保守的敏感性检查，并不等于重新发现了一套生物学结果。

C 说明：样本总信号没有被少数极端样本完全支配，因此后续差异更可能来自特征结构，而不是单纯的总量失控。

图 S1 的意思是：主分析峰经过 QC 变异筛选，严格阈值下也保留了一个固定敏感性集合。QC 证明分析输入可用，不证明任何生物学机制。

### 图 S2：性别会不会影响菌群结果

这张图从群落整体、alpha 多样性和单个物种/功能三个层面检查性别相关效应。群落层只有 E6 和 E8 的 sex×来源谱系比较通过 BH；单特征层能筛出不少候选，但没有 cage ID，而且雌雄可能分笼。

A 说明：性别相关变化分散在不同物种和功能上，并不是所有条目朝同一个方向改变，因此它更像一个需要校正的背景因素，而不是当前主线。

B 说明：雌雄在部分阶段的群落整体结构确实有分开，但这种差异可能同时受到分笼和饲养环境影响，不能直接解释成性别特异机制。

C 说明：alpha 多样性的性别效应随阶段变化，没有形成一条稳定、贯穿所有阶段的性别模式。

D 说明：单特征层的性别候选适合后续复核，不足以支持性别驱动的机制结论；主分析因此把性别作为校正项，并把这些结果留在探索层。

图 S2 的意思是：数据中存在性别相关结构，主模型因此要校正性别；现有元数据无法把性别效应与笼位、饲养环境彻底分开，所以它只能作为探索结果。

### 图 S3：RNA 数据有没有被技术问题主导

A 面板比较各组织的文库大小范围，检查测序深度是否异常。B 面板显示表达过滤后还剩多少基因，判断不同组织的可分析信息量。C 面板列出需要人工复核的标记和实际排除数，本次自动排除数为 0。

A 说明：各组织的测序深度处在可用范围内，没有看到一个由极端文库大小主导的结果。

B 说明：不同组织保留下来的基因量不同，反映的是输入材料和组织本身的信息量差异，不应把基因数多误读成生物学效应更强。

C 说明：本次没有因为自动质控规则直接删掉样本；标记项是需要人工复核的审计信息，不是被判定为失败的样本清单。

图 S3 的意思是：E8 普通组织 684 列和 SCN 60 列都从 raw count 进入统一处理，没有因为人工挑样而形成当前结果。Recover RNA 和 A1 至 A12 因元数据不足没有进入正式模型。

### 图 S5：节律统计稳健性检查

这张图不承担新的生物学主结论，只检查图 3 的节律调用是否依赖某一个端点、标准正弦或 ZT 标签排列。它属于统计方法审计，所以放在补充材料。

A 面板把完整数据、删除 ZT0、删除 ZT24 和离散时间 waveform 检查放在同一张矩阵里。它说明节律结果有强弱层次：完整 cosinor 显著，不等于换掉一个端点后仍然保留。

B 面板给出保守谐波子集的比例。三层都能看到可重复的 24 小时成分，但有一部分波形偏离标准正弦，因此不能把所有 q<0.05 都解释成规则的正弦节律。

C 面板把真实 ZT 标签与随机打乱 ZT 后的零分布比较，检查节律信号是否可能由标签排列或分析流程制造。它是对主结果的校准，不是额外的生物学发现。

图 S5 的意思是：主节律结果不是由单个端点简单造成的，但保守层仍然必要。正文使用统一的 24 小时 cosinor 做主筛选，补充图 S5 用来说明哪些结果更稳、哪些结果波形更复杂。

### 图 S4：2,838 个微生物功能的相位索引

这张大热图每一行是一个功能，每一列是一个来源谱系和阶段。颜色表示通过主节律检验后估计的峰值时间，空白表示该设计格没有通过主筛选。所有行按 GMF E8 的峰值时间排序，所以 GMF E8 那一列天然呈平滑渐变，这只是排序结果，不是该阶段节律更强。

这张图说明：功能节律的峰值时间会在来源和阶段之间重新排列，热图适合查找候选功能和相位迁移，不适合单独用来判断组间效应或机制因果。

图 S4 的意思是：它方便逐项查某个功能在哪个阶段、哪个时间达到峰值，也能看相位结构如何更替。它不负责正式判断两组节律是否不同，正式比较仍使用图 3 的 E0 校正模型。

## 如被问到，可以直接这样答

### "24 小时 cosinor 到底做了什么？"

它用一条周期固定为 24 小时的波形拟合一天中的 5 个采样点，再检验这条波形是否有可信的起伏。它适合做统一的第一轮节律筛选，但真实波形不一定是标准正弦，所以我们另外做了端点删除和离散时间检验，判断结论是否依赖某一个时点或过度依赖正弦假设。

### "q<0.05 是不是说明变化很大？"

不是。q 值回答的是证据是否超过多重检验后的筛选线，不回答效应有多大。判断生物学意义还要同时看变化幅度、方向、跨阶段是否重复，以及能否被独立实验验证。

### "韦恩图里一边显著、另一边不显著，能不能说两组有差异？"

不能直接这样说。韦恩图用于清点两组各自检出的节律成员。正式判断两组波形是否不同，需要在同一个模型里直接检验组别和节律项的交互，并在暴露或复磁比较中扣除 E0 起点差。

### "为什么不只看 PCoA？"

PCoA 是把几千个特征压缩到两个坐标，适合看样本整体分布，但二维图会丢失信息，也不能自动扣除起点差和同期对照变化。它是群落概览，不是恢复是否成立的唯一证据。

### "为什么 GMF_R 和 GMF 看起来还相距很远？"

因为 R 阶段的 GMF 不是 E8 的 GMF。它是继续在地磁场中经历相同时间和流程的同期对照。GMF 支线本身也会变化。再加上粪便是随机横断面采样，不能把二维 PCoA 上的距离理解成同一批鼠没有恢复。我们用 E0 校正和同期对照来判断复磁期的残余差异。

### "现在能不能说恢复了？"

可以说有部分方向性回归，不能说恢复正常。因为整体轨迹没有回到原暴露路径上，尤其物种和功能层的路径外变化在 R+8 仍然明显。

### "为什么不直接讲丁酸？"

当前正式统计没有支持任何单一机制轴。非靶向代谢里也没有乙酸、丙酸或丁酸的可靠候选峰。先做靶向 SCFA 定量，比先把故事写成丁酸更稳。

### "为什么不做 FMT？"

原始粪便的供体来源和笼位信息还没有完全核清。现阶段更省样本、也更容易解释的是靶向代谢、绝对定量和结肠验证。FMT 可以作为后续选择，不是现在的第一步。

### "为什么主要讲 E8 的结肠，其他 RNA 去哪里了？"

其他 RNA 没有丢。E8 有 17 种普通组织共 684 列，另有 SCN 60 列。全组织结果展示在图 7 和图 8，结肠专项结果在图 9。结肠被单独拿出来，是因为当前研究问题落在肠道菌群与结肠屏障，结肠与主线的生物学距离最近。其他组织用于判断变化是全身一致，还是组织特异，不作为恢复机制的直接证据。

### "为什么 E8 RNA 能讲，Recover RNA 不能做恢复节律？"

E8 的 10 种普通组织和 SCN 有条件、性别及 ZT 信息，可以进行 24 小时节律分析；7 种静态组织至少可以比较表达水平。Recover RNA 虽然有 252 列表达数据，但缺少恢复周和 ZT 映射，所以目前不能区分 R+4 与 R+8，也不能判断恢复期波形。