# 非测序湿实验清单（可直接交给师姐）

> 项目：LC-P20260305017  
> 版本：2026-08-13  
> 目标：尽量利用现有库存样本，以少量非测序实验验证“候选微生物代谢轴—结肠上皮时钟/屏障”。  
> 不包含：重新建立长期零磁动物实验、任何新增测序。

## 一、先统一分组

| 简写 | 实际含义 |
|---|---|
| G-E0 | GMF来源队列，暴露开始前 |
| Z-E0 | ZMF来源队列，暴露开始前 |
| G-E8 | GMF来源队列，持续GMF 8周 |
| Z-E8 | ZMF来源队列，ZMF 8周 |
| G-R4 | GMF来源队列继续GMF 4周；Z-R4的同期/同年龄流程对照 |
| Z-R4 | ZMF来源队列切回GMF 4周 |
| G-R8 | GMF来源队列继续GMF 8周；Z-R8的同期/同年龄流程对照 |
| Z-R8 | ZMF来源队列切回GMF 8周 |

每个完整阶段通常为：2来源谱系 × 5 ZT × 2性别 × 6标本＝120份。

- 数据记录显示 E0、E8、R+8 各120份；R+4代谢组120份，宏基因组116份。
- R+4缺少的4份宏基因组位于 `Z-R4 × ZT24 × M`，但实体样本是否仍在须盘点。
- 完整的机制验证最好包括 E0、E8、R+4、R+8，共最多480份；实际以库存和样本质量为准。
- 这些是随机粪便标本，不是可追踪的同鼠纵向样本。

## 二、师姐先反馈的样本与平台信息

请直接在下列项目后填写：

- [ ] 是否有未固定的完整冻存粪便：__________
- [ ] 覆盖阶段：E0 / E8 / R+4 / R+8 / 其他__________
- [ ] 是否保留ZT、性别和原始管号：__________
- [ ] 保存温度、保护剂、冻融次数：__________
- [ ] 每管大致剩余质量：__________
- [ ] 是否有结肠鲜冻组织、RNA、蛋白或FFPE：__________
- [ ] 结肠是否能映射到阶段、ZT、性别：__________
- [ ] 是否有血清/血浆、盲肠内容物：__________
- [ ] 可做GC–MS靶向SCFA：是 / 否 / 可合作
- [ ] 可做LC–MS/MS靶向胆汁酸、吲哚和胆碱轴：是 / 否 / 可合作
- [ ] 可做qPCR或ddPCR：是 / 否
- [ ] 可做Western、IF/IHC、H&E、AB-PAS：__________
- [ ] 可做Caco-2/HT-29、结肠类器官或PER2::LUC：__________
- [ ] 可做TEER或FITC-dextran通透性：__________
- [ ] 普通GMF条件下短期FMT是否仅作为以后保留：__________

## 三、共同实验规范

1. 正式检测前编码盲法；样本标签只保留匿名实验号。
2. 每个检测批次同时混入G/Z、E0/E8/R4/R8、5个ZT和两性，禁止按实验组分批。
3. 先用约5%–10%的平衡样本做方法学预实验，只看回收率、LOD/LOQ和样本消耗，不用这批数据挑生物学结论。
4. 保留至少一份未解冻备份；记录每次冻融。
5. E0必须进入任何“零磁造成变化”的正式验证。若经费只能测E8/R阶段，结果只能称阶段相关验证。
6. 恢复必须使用G-R4/G-R8同期对照，不能只比较Z-E8与Z-R4/Z-R8。
7. 不以`P>0.05`证明相同；少量主读出使用预设等效界值与TOST/置信区间。
8. 所有节律读出覆盖5个ZT；只有单时点或峰/谷时，不能称为节律改变。

# A级：当前建议必做

## A0｜库存样本盘点与可用性预实验

**目的**：确认库存能否支撑阶段、ZT和性别平衡验证。

每支冻存管建立一行记录：

- physical sample ID、冰箱位置、材料类型；
- lineage、stage、ZT、sex；
- 保存方法、剩余质量、冻融次数；
- 对应宏基因组ID、代谢组ID、RNA/组织ID；
- 是否来自同一原始粪便的分装及证据来源。

**Go**：E0/E8/R+4/R+8的关键组仍覆盖5个ZT，标签可靠且多数分析物高于LOQ。  
**No-go**：阶段或ZT无法映射、严重冻融、只有单一ZT；不能开展正式节律验证。

## A1｜正文候选峰的标准品确认

任何准备以化合物名称写入正文的非靶向峰，均需用 authentic standard确认：

- 当前候选：METP0145（Choline）、METP0221（Tetradecanedioic acid）、METP0089（Biotin）；
- 只确认Gate 0后仍准备保留的峰，不必为了旧候选全部投入。

**检测**：保留时间、精确质量、MS/MS碎片和加标回收；使用溶剂空白、基质空白和标准曲线。

**Go**：保留时间和特征碎片匹配，加标后原峰按预期增强。  
**No-go**：不匹配；全文只保留峰ID，不再使用候选化合物名称。

**结论上限**：只能确认化合物身份，不能证明菌源性或介导作用。

## A2｜四类候选代谢轴的小型靶向面板

先公平筛选，再决定是否讲丁酸。

### 最小面板

- **发酵/SCFA**：乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、琥珀酸；可加异丁酸、异戊酸。
- **色氨酸—吲哚**：色氨酸、indole、IAA、IPA。
- **胆汁酸**：CA、DCA、LCA、βMCA/TβMCA等适合小鼠的代表物。
- **胆碱轴**：choline、betaine、TMA、TMAO。

### 方法和质控

- SCFA优先带稳定同位素内标的GC–MS；其余使用靶向LC–MS/MS；
- 结果换算为绝对浓度，统一按粪便湿重或干重；
- 6–8点标准曲线、提取空白、加标回收；
- 混合QC每8–10针一次；
- QC CV目标≤15%，复杂基质原则上不超过20%；
- 运行顺序按lineage、stage、ZT、sex分层随机。

### 正式读出

- MESOR、振幅、相位；
- E0校正的E8偏离；
- R+4/R+8同期对照校正残余；
- R+8−R+4直接进展；
- GMF来源支路漂移及少量主指标等效性。

**Go**：至少一条代谢轴经面板内FDR校正后，同时获得暴露、恢复方向和技术QC支持，且不由单一ZT或单一性别驱动。  
**No-go**：绝对定量不复现、只有旧非靶向峰显著，或所谓恢复完全由GMF共同漂移解释；不进入具体代谢物机制。

**结论上限**：证明真实化学物的群体时间结构与阶段共同变化，不能证明菌源或中介作用。

## A3｜菌和功能基因的绝对定量

建议qPCR/ddPCR小面板：

- 总细菌16S；
- `Anaerostipes hadrus`物种特异标记；
- SCFA/丁酸：butyryl-CoA:acetate CoA-transferase、`buk`；
- 吲哚：`tnaA`；
- 次级胆汁酸：`baiCD`；
- 胆碱转TMA：`cutC`。

实际引物必须经过数据库in-silico特异性检查、阳性模板验证和标准曲线验证；若某靶点不能获得可靠特异引物，就不做该项。

### 质控

- gBlock/质粒或可靠标准品；
- 提取阴性、NTC、阳性模板；
- 扩增效率90%–110%；
- 报告LOD/LOQ；
- 按粪便重量统一输入；
- A2和A3尽可能来自同一原始样本相邻分装。

**Go**：候选菌或功能的绝对量复现既有方向，并且相应代谢轴在A2也通过。  
**No-go**：候选低于LOQ、绝对量与相对丰度方向相反，或对应代谢物不支持；删除具体“物种—代谢物”机制。

**结论上限**：功能基因仍表示群落潜力，不能证明它属于`A. hadrus`或产生了测得代谢物。

## A4｜结肠时钟—屏障主轴验证

只有组织能明确映射到stage、ZT和sex时，才进入正式恢复分析。

### RT-qPCR预注册小面板

- **时钟**：`Arntl`、`Per2`、`Cry2`、`Nr1d1`、`Dbp`；
- **屏障/黏液**：`Muc2`、`Tjp1`、`Ocln`、`Cldn1`；
- **抗菌/STAT3**：`Reg3g`、`Socs3`，并视样本表达选择`Il22`；
- **炎症次级**：`Il1b`、`Tnf`、`Il6`。

不要继续扩大基因列表。正文以“时钟＋屏障”为主，炎症只作次级解释。

### 至少增加一个正交层

- Western或IF/IHC：ZO-1、OCLN、MUC2；
- p-STAT3/STAT3；
- 若有固定组织：H&E与AB-PAS黏液染色，盲法评分。

### 质控

- 检查RNA质量；
- 不单独使用可能昼夜波动的`Gapdh`作内参，从`Rplp0/Ppia/Hprt/Tbp`中验证至少两个稳定内参；
- no-RT、NTC；Western处于线性范围；
- 胶、板和切片批次跨组平衡；组织学盲法评分。

**Go**：至少一个预注册时钟读出和一个屏障读出方向协调，并获得蛋白或组织学正交支持。恢复结论还须有R阶段、ZT映射和GMF同期校正。  
**No-go**：只有单个基因、无正交支持，或恢复组织无法映射stage/ZT；宿主证据仅保留为E8背景。

**结论上限**：证明结肠组织伴随变化；whole-colon不能写上皮特异，标志物改变也不能直接写成功能性屏障受损。

# B级：性价比最高的优先增强

## B1｜胜出代谢物的结肠上皮细胞/类器官实验

只有A2确定胜出代谢轴后才决定用丁酸、胆汁酸、吲哚分子或胆碱轴分子。

### 模型

- 优先：至少3只独立普通小鼠来源的结肠类器官，或PER2::LUC模型；
- 条件有限：同步化Caco-2/HT-29 2D屏障模型；
- 培养孔是技术重复，不是独立生物学n。

### 处理

- vehicle；
- 根据A2实测浓度设置生理低、中、高浓度；
- 阳性对照；
- 一个与胜出候选匹配的药理阻断或siRNA组；
- 选择一个depletion/add-back或inhibitor/rescue设计。

### 读出

- 时钟：PER2发光或每4–6小时一次、持续24–36小时的qPCR/蛋白时间序列；
- 屏障：TEER、FITC-dextran通透性、ZO-1定位、MUC2；
- 次级：p-STAT3或上皮炎症信号；
- 细胞活性/毒性。

### 关键控制

- 至少3次不同日期独立实验；
- SCFA实验严格匹配pH、钠离子和渗透压；
- 浓度不得远高于库存样本实测范围；
- 单一终点不能声称节律改变。

**Go**：非毒性生理浓度下同时改变时钟参数和屏障功能，阻断后效应减弱或回补后恢复。  
**No-go**：只在高毒性浓度生效、只有单时点表达变化或阻断不能复现；停止该机制轴。

**结论上限**：支持候选物对上皮读出的体外充分性和通路依赖；不能证明它在原动物中是必要中介。

## B2｜无菌粪水—上皮模型

### 目的

检验归档粪便中的可溶性环境是否具有上皮生物活性。

### 首轮分组

- G-E8、Z-E8、G-R4、Z-R4；条件允许再加入E0和R+8；
- 每组按预设规则建立至少3个**不重叠**样本池；一个大混合池不能伪装成多个生物学重复。

### 操作和读出

- 按相同粪便质量制备、0.22 μm过滤；
- 测pH、渗透压、总蛋白、内毒素和候选代谢物；
- 时钟和屏障读出同B1；
- 可在候选物低水平组按生理浓度回补。

**Go**：Z-E8粪水效应不同于G-E8，Z-R阶段效应相对同期G-R阶段朝对照移动，并能由候选物部分复制或回补。  
**No-go**：结果由pH、内毒素或毒性解释，或非重叠样本池之间不稳定。

**结论上限**：只能说明归档粪便可溶性成分具有体外活性，不能等同于活菌群转移。

# C级：远期保留，不作为当前论文启动条件

## C1｜普通GMF条件下短期FMT

- 抗生素清除SPF受体或无菌受体；
- 首轮G-E8与Z-E8，成功后加入G-R4/Z-R4及E0校正；
- 每组至少3个不重叠供体池，每池进入至少2个独立受体笼；
- 受体随机化、盲法；供体池、受体笼、个体鼠为不同层级；
- 不新增测序，以候选菌/功能qPCR、靶向代谢、结肠时钟/屏障和必要时FITC-dextran为读出。

**Go**：多个独立供体池和受体笼重复同方向效应，且候选代谢物与结肠终点共同出现。  
**No-go**：单个供体池有效、定植失败或笼位解释主要差异。

**结论上限**：阳性可证明归档菌群状态在普通GMF环境下具有可转移性；仍不能补足原始零磁暴露的独立重复或证明菌群对磁场效应具有必要性。

## C2｜候选物或定义菌群补救

只有A、B级连续通过后再启动：

- 按自然节律时相和错时两种方案给予胜出代谢物；
- 或在定义菌群中加入/去除候选菌；
- 检测结肠时钟、屏障及一个功能终点；
- 只有“去除失效＋加入恢复＋下游补救”共同成立，才接近完整因果链。

## 四、候选机制升级门槛

| 已通过层级 | 论文允许表述 |
|---|---|
| 现有组学＋Gate 0 | “候选关联轴” |
| 再通过真实化学物/绝对定量 | “经靶向验证的跨层候选轴” |
| 再通过结肠qPCR＋蛋白/组织学 | “与结肠时钟—屏障变化相伴的候选机制” |
| 再通过细胞/类器官阻断或回补 | “具有体外充分性和通路依赖的候选机制” |
| 再通过多供体FMT/定义菌群 | 才可谨慎讨论“可转移”或“功能连接” |

## 五、最省成本的实际顺序

1. A0样本盘点；
2. Gate 0数据重分析，冻结四类候选轴；
3. A1/A2结构确认与小型靶向代谢；
4. A3绝对qPCR/ddPCR；
5. 只让胜出轴进入A4结肠验证；
6. 结果一致时再做B1；
7. B2视归档粪便状态和工作量决定；
8. FMT长期保留。

这样可避免先预设丁酸成立，也能把每一笔实验经费放在会改变论文结论的节点上。